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Western印跡法，也被稱(chēng)為Westernbloter、Westernblotting，是檢測(cè)蛋白質(zhì)的重要方法之一。

其操作流程如下：

1.細(xì)胞裂解：將待檢樣品進(jìn)行機(jī)械或化學(xué)裂解，以釋放蛋白質(zhì)。
2.SDS-PAGE電泳：將蛋白質(zhì)樣品加入SDS-PAGE凝膠，根據(jù)分子量大小進(jìn)行電泳分離。
3.轉(zhuǎn)印：將分離的蛋白質(zhì)遷移到聚丙烯酰胺凝膠薄膜（PVDF）或硝酸纖維素薄膜上。
4.封閉：使用阻斷劑（例如非脂乳精或牛血清白蛋白）封閉薄膜上未被蛋白質(zhì)占據(jù)的位置，防止非特異性結(jié)合。
5.抗體孵育：將特異性抗體與薄膜上的目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合，形成免疫復(fù)合物。
6.洗滌：洗去未結(jié)合的抗體和其他雜質(zhì)。
7.二次抗體孵育：加入與第一抗體親和的酶標(biāo)記二抗，形成免疫復(fù)合物。
8.洗滌：洗去未結(jié)合的二次抗體和其他雜質(zhì)。
9.顯色：使用酶底物或熒光標(biāo)記物，使免疫復(fù)合物產(chǎn)生可見(jiàn)的信號(hào)。
10.影像分析：使用成像系統(tǒng)記錄并分析蛋白質(zhì)帶的強(qiáng)度和大小。
以上是WesternBlotting的操作流程，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)檢測(cè)和研究中。

下面簡(jiǎn)要介紹了WesternBlotting實(shí)驗(yàn)的步驟。
1、材料組織：對(duì)組織塊進(jìn)行稱(chēng)重
2、通過(guò)使用液氮，可以破碎組織樣本。
3、將RIPA緩沖液添加到每克組織中，每克組織的RIPA緩沖液用量為3ml。然后，將PMSF加入到每克組織中，PMSF濃度為10mg/ml，每克組織需要添加30μl的PMSF。
請(qǐng)將樣品保持在4℃，然后使用Polytron進(jìn)行進(jìn)一步的勻漿（15,000轉(zhuǎn)/分，持續(xù)1分鐘）。
4、在每克組織中加入PMSF（每克30毫升）示，PMSF濃度為10毫克/毫升）。然后將樣品放在冰上孵化30分鐘。
5、將樣品放入離心管中，將離心管放入離心機(jī)中，在4℃下進(jìn)行離心操作，設(shè)置離心力約為20,000g（約15,000轉(zhuǎn)速），離心時(shí)間為15分鐘。
6、細(xì)胞裂解液即為上清液，可以被儲(chǔ)存在-20℃的容器中。
7、使用布拉德福比色法來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。
8、取相同質(zhì)量的細(xì)胞裂解液，其體積和蛋白濃度保持不變，然后加入等量的2×電泳樣品緩沖液。
9、將水煮沸后，將東西浸泡在熱水中三分鐘。
上樣
11、電泳過(guò)程中使用20mA的濃縮膠和35mA的分離膠。
12、電轉(zhuǎn)膜儀通過(guò)電流轉(zhuǎn)移膜(100mA40分鐘)。
13、薄膜采用麗春紅進(jìn)行染色，而膠則使用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色。
14、進(jìn)行Westernblot實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以使用試劑盒進(jìn)行著色。
15、分析比對(duì)記錄

進(jìn)行WesternBlotting的具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：
以下操作程序供西方參考：
1、進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品收集(Proteinsamplecollection)
可以使用適當(dāng)?shù)娜芙庖簩?duì)貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣本進(jìn)行裂解。對(duì)于一些特定的亞細(xì)胞組分蛋白，例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞質(zhì)蛋白、線(xiàn)粒體蛋白等，可以通過(guò)參考相關(guān)文獻(xiàn)的方法提取，也可以使用試劑盒來(lái)提取。
在收集蛋白質(zhì)樣品后，需要檢測(cè)每個(gè)樣品的蛋白質(zhì)濃度，以確保它們的上樣量一致。根據(jù)使用的裂解液不同，我們需要選擇合適的方法來(lái)測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。不同的蛋白質(zhì)濃度測(cè)量方法在去垢劑和氧化劑方面存在兼容性差異。如果我們使用的是北京博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的WIP細(xì)胞裂解液，我們可以選擇使用BCA蛋白濃度測(cè)量試劑盒。
2、電泳，又稱(chēng)為電泳分離技術(shù)，是一種基于電場(chǎng)效應(yīng)的物質(zhì)分離方法。它利用帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中的遷移速度不同，通過(guò)電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)，將混合物中的物質(zhì)分離開(kāi)來(lái)。電泳廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)等領(lǐng)域，以實(shí)現(xiàn)樣品分離、純化、定性和定量分析等。
（1）、準(zhǔn)備SDS-PAGE膠液
可以參考一些文獻(xiàn)，來(lái)制備SDS-PAGE電泳凝膠，并且也能使用由博奧森制造的SDS-PAGE疑膠制備試劑盒進(jìn)行制備。該試劑盒包括配方制備不同濃度SDS-PAGE所需的所有試劑（除了水和凝膠制備器具）。
樣品處理
將適量的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液加入到收集的蛋白樣品中。例如，可以使用2X或5X濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的緩沖液可以減少上樣的體積，從而在相同的上樣孔中能夠上樣更多的蛋白。可以按照相關(guān)文獻(xiàn)制備5X濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，也可以使用博奧森公司制造的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5X）。在100℃或熱水中加熱3-5分鐘，以確保蛋白質(zhì)得到充分變性。
上樣與電泳
在冷卻至室溫后，可以將蛋白質(zhì)樣品直接置于SDS-PAGE膠的樣品孔中。為了更方便地觀察電泳性能和轉(zhuǎn)膜效果，并判斷蛋白質(zhì)的分子量，最好使用預(yù)先染色的蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)。
進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)時(shí)，通常建議在樣品加載到上膠之前使用低壓恒壓電泳。而當(dāng)溴酚藍(lán)進(jìn)入下膠后，建議使用高壓恒壓電泳。對(duì)于Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置或類(lèi)似裝置，低壓可以設(shè)置在80-100V之間，而高壓則可以設(shè)置在約120V左右。如果進(jìn)行SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)，可以使用普通的電泳儀來(lái)滿(mǎn)足要求。另外，為了方便電泳操作，可以采用SDS-PAGE全程恒壓的方法。一般來(lái)說(shuō)，可以將電壓設(shè)置為100V，然后將時(shí)間設(shè)置為90至120分鐘。通過(guò)設(shè)置合適的時(shí)間，可以避免頻繁進(jìn)行電泳操作。
在一般的電泳過(guò)程中，可以通過(guò)以下兩種方式來(lái)結(jié)束電泳：一是等到溴酚藍(lán)染料達(dá)到膠的底部周?chē)Ｖ闺娪荆歉鶕?jù)預(yù)先設(shè)定的蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)來(lái)結(jié)束電泳。根據(jù)預(yù)期的分離效果，當(dāng)目的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)適度的分離后，可以選擇結(jié)束電泳過(guò)程。
3、膜轉(zhuǎn)移技術(shù)
針對(duì)Western實(shí)驗(yàn)，我們建議選擇PVDF膜。不過(guò)，你也可以選擇硝酸纖維素膜（NC膜）或PVDF膜（二氟化樹(shù)脂膜孔徑為0.45um）。需要注意的是，硝酸纖維素膜相對(duì)脆弱，在操作過(guò)程中容易破裂，特別是用鑷子夾住的時(shí)候。所以在使用時(shí)請(qǐng)參考制造商推薦的使用步驟。
一般來(lái)說(shuō)，使用Bio-Rad標(biāo)準(zhǔn)的濕式膜轉(zhuǎn)換設(shè)備時(shí)，推薦的膜轉(zhuǎn)換電壓設(shè)置為120V，膜轉(zhuǎn)換時(shí)間為30-60分鐘。具體的膜轉(zhuǎn)換時(shí)間應(yīng)根據(jù)目的蛋白質(zhì)的分子量而定。如果目的蛋白質(zhì)的分子量較大，那么所需的膜轉(zhuǎn)換時(shí)間就會(huì)更長(zhǎng)一些；而如果目的蛋白質(zhì)的含量較低，那么所需的膜轉(zhuǎn)換時(shí)間就會(huì)相應(yīng)減少。
在進(jìn)行轉(zhuǎn)膜過(guò)程中，尤其是高電流快速轉(zhuǎn)膜時(shí)，通常會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象。為了最佳效果，建議將轉(zhuǎn)膜槽放置于冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。可以通過(guò)觀察使用的預(yù)染蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)估轉(zhuǎn)膜效果，通常來(lái)說(shuō)，最大的1-2個(gè)雜帶較難完全轉(zhuǎn)移到膜上。另外，通過(guò)使用麗春紅染色液來(lái)染色膜，也可以觀察轉(zhuǎn)膜的實(shí)際效果。而使用考馬斯亮藍(lán)快速染色液來(lái)染色完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠，可以觀察蛋白質(zhì)的殘留情況。
4、封閉(Blocking)
轉(zhuǎn)膜完成后，應(yīng)立即將蛋白膜放入預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液中，沖洗1-2分鐘，以去除膜上的轉(zhuǎn)膜液。在轉(zhuǎn)膜完成后的整個(gè)過(guò)程中，務(wù)必注意保持膜的濕潤(rùn)，避免膜干燥，否則可能導(dǎo)致較高的背景信號(hào)產(chǎn)生。
使用微型臺(tái)式真空泵抽取洗滌液，然后加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動(dòng)，在室溫下封閉60分鐘。對(duì)于一些高背景的抗體，可以在4℃條件下封閉一夜。
5、主要抗體孵育
根據(jù)Western一抗說(shuō)明書(shū)的指導(dǎo)，以適當(dāng)?shù)谋壤♂學(xué)estern一抗稀釋液。
使用微型臺(tái)式真空泵吸取封閉液后，立即添加稀釋好的抗體，并在室溫或4℃的側(cè)擺搖床上緩慢搖晃孵化一小時(shí)。若一小時(shí)的孵化效果不佳，可以在4℃下繼續(xù)緩慢搖晃孵化一晚上。之后回收抗體，加入Western洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖晃清洗5-10分鐘。吸取洗滌液后，再次加入洗滌液進(jìn)行清洗5-10分鐘，總共進(jìn)行3次清洗。若結(jié)果的背景較高，可以適當(dāng)延長(zhǎng)清洗時(shí)間并增加清洗頻率。
6、二次抗體孵育
根據(jù)二抗說(shuō)明書(shū)的指導(dǎo)，使用Western二抗稀釋液適當(dāng)稀釋辣根過(guò)氧化物酶(HRP)二抗標(biāo)記。
使用微型臺(tái)式真空泵吸取洗滌液后，立即加入稀釋的二抗，并在側(cè)擺搖床上緩慢搖晃孵化一小時(shí)，溫度保持在室溫或4℃。取出二抗后，加入Western洗滌液，再次在搖床上緩慢搖晃清洗5-10分鐘。將洗滌液吸取后再次加入洗滌液，繼續(xù)清洗5-10分鐘。總共需要進(jìn)行3次清洗。如果結(jié)果背景較高，可以適當(dāng)延長(zhǎng)清洗時(shí)間，增加清洗的頻率。
7、蛋白質(zhì)的檢測(cè)
使用BeyoECL和Western瑩光檢測(cè)試劑等ECL類(lèi)試劑，根據(jù)相關(guān)說(shuō)明書(shū)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。
在片子處理的過(guò)程中，可以使用X光自動(dòng)洗片機(jī)。如果沒(méi)有自動(dòng)洗片機(jī)，可以使用顯影定影試劑盒，手工配置顯影液和定影液來(lái)進(jìn)行洗片處理。
8、薄膜再利用
如果蛋白質(zhì)樣品非常寶貴，可以使用Western一次抗體和二次抗體清除液來(lái)處理蛋白質(zhì)膜，以便可以重復(fù)使用。

在實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要注意以下三點(diǎn)事項(xiàng)：
1.安全第一：在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須要注意安全。要穿戴實(shí)驗(yàn)室所要求的防護(hù)裝備，如實(shí)驗(yàn)服、手套、護(hù)目鏡等，并遵守實(shí)驗(yàn)室的安全操作規(guī)程。
2.仔細(xì)觀察：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，要仔細(xì)觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和結(jié)果，注意記錄和收集有關(guān)的數(shù)據(jù)和信息。只有充分觀察和記錄，才能得出準(zhǔn)確可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。
3.保持實(shí)驗(yàn)環(huán)境整潔：實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保持干凈整潔。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，要清理實(shí)驗(yàn)臺(tái)、清洗實(shí)驗(yàn)器材，并將廢棄物正確妥善處理。保持實(shí)驗(yàn)環(huán)境整潔有助于提高實(shí)驗(yàn)的效率和準(zhǔn)確性。

實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的問(wèn)題及處理辦法

【2023/10/26 17:33:58】